基因工程實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目化教程（韋平和）
《基因工程實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目化教程》為“十三五”江蘇省高等學(xué)校重點(diǎn)教材。全書選取L-天冬酰胺酶Ⅱ?yàn)槟繕?biāo)產(chǎn)品，以大腸桿菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB）的克隆和表達(dá)為主線，按照基因工程的操作流程將相關(guān)知識(shí)和技能分解為前后連貫的9個(gè)項(xiàng)目、34項(xiàng)任務(wù)，涉及的內(nèi)容主要包括核酸分離純化、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、DNA體外重組、重組子篩選和鑒定、基因誘導(dǎo)表達(dá)與產(chǎn)物分析、瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳以及基因工程實(shí)驗(yàn)安全與防護(hù)等。本書突出知識(shí)、技能和素質(zhì)的同步提升，深入淺出，圖文并茂，適合項(xiàng)目載體、任務(wù)驅(qū)動(dòng)、學(xué)生主體的行動(dòng)導(dǎo)向教學(xué)。
本書可供職業(yè)本科、應(yīng)用型本科院校生物科學(xué)類、生物工程類、藥學(xué)類專業(yè)使用，也可供高職高專生物技術(shù)類、制藥技術(shù)類等相關(guān)專業(yè)使用，還可以作為相關(guān)企事業(yè)單位參考用書。
項(xiàng)目一基因工程實(shí)驗(yàn)安全及防護(hù) 001
【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 001
【項(xiàng)目說(shuō)明】 001
【基礎(chǔ)知識(shí)】 001
（一）基因工程概述 001
（二）基因工程實(shí)驗(yàn)安全及生物安全操作規(guī)范 005
【項(xiàng)目實(shí)施】 010
任務(wù)1-1基因工程實(shí)驗(yàn)常用的有毒化學(xué)試劑及其防護(hù) 010
任務(wù)1-2掌握基因工程實(shí)驗(yàn)常見儀器設(shè)備的操作規(guī)程和注意事項(xiàng) 014
任務(wù)1-3基因工程實(shí)驗(yàn)生物危害廢品的處理 019
【能力拓展】 021
（一）火災(zāi)及預(yù)防 021
（二）觸電及急救 026
【實(shí)踐練習(xí)】 032
項(xiàng)目二基因工程實(shí)驗(yàn)常用溶液及培養(yǎng)基配制 034
【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 034
【項(xiàng)目說(shuō)明】 034
【基礎(chǔ)知識(shí)】 034
（一）化學(xué)試劑的規(guī)格和生物試劑的分類 034
（二）溶液濃度的表示、調(diào)整和互換 036
（三）溶液的配制 038
（四）生物實(shí)驗(yàn)室玻璃器皿的洗滌 042
【項(xiàng)目實(shí)施】 044
任務(wù)2-1移液器的使用與維護(hù) 044
任務(wù)2-2配制常用溶液和抗生素 048
任務(wù)2-3常用細(xì)菌培養(yǎng)基及配制 052
【能力拓展】 055
（一）常用酵母培養(yǎng)基 055
（二）試劑盒 057
（三）體外診斷試劑 059
【實(shí)踐練習(xí)】 062
項(xiàng)目三大腸桿菌基因組DNA的制備 063
【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 063
【項(xiàng)目說(shuō)明】 063
【基礎(chǔ)知識(shí)】 063
（一）核酸的理化性質(zhì) 063
（二）核酸的分離提取原理 067
（三）核酸的固相提取方法 071
【項(xiàng)目實(shí)施】 073
任務(wù)3-1制備大腸桿菌基因組DNA的操作準(zhǔn)備 073
任務(wù)3-2SDS法制備大腸桿菌基因組DNA 076
任務(wù)3-3CTAB法制備大腸桿菌基因組DNA 079
任務(wù)3-4煮沸法制備大腸桿菌基因組DNA 082
【能力拓展】 083
（一）動(dòng)物基因組DNA的提取 083
（二）植物基因組DNA的提取 085
（三）酵母基因組DNA的提取 085
（四）總RNA和mRNA的提取 086
【實(shí)踐練習(xí)】 088
項(xiàng)目四PCR擴(kuò)增大腸桿菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB） 089
【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 089
【項(xiàng)目說(shuō)明】 089
【基礎(chǔ)知識(shí)】 090
（一）目的基因的分離制備 090
（二）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 092
（三）PCR引物設(shè)計(jì) 095
（四）降落PCR 100
（五）PCR技術(shù)的應(yīng)用 101
【項(xiàng)目實(shí)施】 101
任務(wù)4-1操作準(zhǔn)備 101
任務(wù)4-2L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB）引物設(shè)計(jì) 106
任務(wù)4-3PCR擴(kuò)增L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB） 110
任務(wù)4-4降落PCR優(yōu)化L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB）擴(kuò)增退火溫度 112
【能力拓展】 114
（一）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 114
（二）菌落PCR 122
（三）常用核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù) 123
【實(shí)踐練習(xí)】 125
項(xiàng)目五質(zhì)粒pET-28a的制備 126
【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 126
【項(xiàng)目說(shuō)明】 126
【基礎(chǔ)知識(shí)】 126
（一）質(zhì)粒 127
（二）pET系列質(zhì)粒 130
（三）質(zhì)粒DNA的提取方法 132
（四）瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒DNA 134
（五）質(zhì)粒DNA濃度和純度檢測(cè) 135
【項(xiàng)目實(shí)施】 135
任務(wù)5-1操作準(zhǔn)備 135
任務(wù)5-2SDS堿裂解法小量制備質(zhì)粒pET-28a 137
任務(wù)5-3SDS堿裂解法大量制備質(zhì)粒pET-28a 141
任務(wù)5-4少量提取質(zhì)粒pET-28a的簡(jiǎn)易方法 142
任務(wù)5-5煮沸裂解法快速提取質(zhì)粒pET-28a 144
【能力拓展】 145
（一）酵母表達(dá)載體 145
（二）質(zhì)粒圖譜的繪制 147
（三）質(zhì)粒資源的獲取方式 151
【實(shí)踐練習(xí)】 155
項(xiàng)目六瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA、PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pET-28a 157
【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 157
【項(xiàng)目說(shuō)明】 157
【基礎(chǔ)知識(shí)】 157
（一）電泳 157
（二）瓊脂糖凝膠電泳 158
（三）核酸電泳的指示劑與染色劑 161
（四）核酸電泳的DNA分子量標(biāo)記 163
【項(xiàng)目實(shí)施】 165
任務(wù)6-1操作準(zhǔn)備 165
任務(wù)6-2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA、質(zhì)粒pET-28a及PCR產(chǎn)物 166
任務(wù)6-3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化回收 172
【能力拓展】 174
（一）新型核酸熒光染料 174
（二）脈沖場(chǎng)凝膠電泳 177
（三）雙相電泳 179
（四）微型凝膠電泳 180
【實(shí)踐練習(xí)】 181
項(xiàng)目七L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB）和質(zhì)粒pET-28a的酶切與連接 182
【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 182
【項(xiàng)目說(shuō)明】 182
【基礎(chǔ)知識(shí)】 182
（一）核酸工具酶及主要功能 182
（二）限制性內(nèi)切核酸酶 183
（三）DNA連接酶 186
（四）重組DNA分子的構(gòu)建 188
【項(xiàng)目實(shí)施】 188
任務(wù)7-1操作準(zhǔn)備 188
任務(wù)7-2目的基因ansB和質(zhì)粒pET-28a的雙酶切 189
任務(wù)7-3目的基因ansB和質(zhì)粒pET-28a酶切產(chǎn)物的檢測(cè)、純化和回收 191
任務(wù)7-4目的基因ansB和質(zhì)粒pET-28a的連接 193
【能力拓展】 195
（一）DNA甲基化酶及其它工具酶 195
（二）Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶的幾種特殊類型 196
（三）目的基因片段與載體分子的連接方法 197
（四）末端轉(zhuǎn)換常用的方法和使用的主要工具酶 198
【實(shí)踐練習(xí)】 199
項(xiàng)目八將重組質(zhì)粒pET-28a-ansB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 200
【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 200
【項(xiàng)目說(shuō)明】 200
【基礎(chǔ)知識(shí)】 201
（一）細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化 201
（二）重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化 203
（三）受體細(xì)胞與感受態(tài) 205
【項(xiàng)目實(shí)施】 206
任務(wù)8-1操作準(zhǔn)備 206
任務(wù)8-2大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備 208
任務(wù)8-3用熱激法將重組質(zhì)粒pET-28a-ansB導(dǎo)入大腸桿菌BL21 210
任務(wù)8-4用電穿孔法將重組質(zhì)粒pET-28a-ansB導(dǎo)入大腸桿菌BL21 212
【能力拓展】 214
（一）重組DNA轉(zhuǎn)化至酵母的方法 214
（二）重組DNA轉(zhuǎn)化至動(dòng)物細(xì)胞的方法 215
（三）轉(zhuǎn)基因技術(shù) 217
【實(shí)踐練習(xí)】 219
項(xiàng)目九重組子的鑒定及ansB基因表達(dá)產(chǎn)物分析 220
【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 220
【項(xiàng)目說(shuō)明】 220
【基礎(chǔ)知識(shí)】 220
（一）重組子的篩選與鑒定 220
（二）目的基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá) 224
（三）基因表達(dá)產(chǎn)物的電泳分析及酶活檢測(cè) 226
【項(xiàng)目實(shí)施】 229
任務(wù)9-1操作準(zhǔn)備 229
任務(wù)9-2重組菌中ansB基因的誘導(dǎo)表達(dá)和粗提取 231
任務(wù)9-3基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè) 232
任務(wù)9-4基因表達(dá)產(chǎn)物的酶活檢測(cè) 235
【能力拓展】 236
（一）蛋白質(zhì)工程 236
（二）大腸桿菌L-天冬酰胺酶Ⅱ的結(jié)構(gòu)與改造 238
（三）重組菌L-天冬酰胺酶Ⅱ的純化策略 241
【實(shí)踐練習(xí)】 242
參考文獻(xiàn) 244
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