目錄
譯者的話
前言
撰稿人
第1章序言 1
第1章 為什么要純化酶？ 3
第1部分 制定純化流程
第2章 蛋白質(zhì)純化的策略與考慮因素 9
1.總則 10
2.蛋白質(zhì)來源 14
3.制備提取物 15
4.大批量純化步驟 15
5.純化的精純過程 16
6.結(jié)論 17
參考文獻 17
第3章 生物信息學在蛋白質(zhì)純化設(shè)計中的應用 18
1.氨基酸序列中的重要信息 19
2.無法從序列中預知的信息 22
3.結(jié)論 22
參考文獻 23
第4章 準備純化工作簡表 24
1.引言 24
2.腳注的重要性 26
3.SDS-PAGE對分析主要蛋白質(zhì)分離組分的價值 26
4.一些常見的錯誤和問題 26
第2部分 操作蛋白質(zhì)和酶的常規(guī)方法
第5章 建立一個實驗室 31
1.配套材料 31
2.檢測和分析的必要條件 32
3.蛋白質(zhì)分級分離的必要條件 33
第6章 緩沖液：原理和實踐 35
1.引言 35
2.理論 35
3.緩沖液的選擇 37
4.緩沖液的制備 39
5.揮發(fā)性緩沖液 40
6.廣譜緩沖液 41
7.緩沖液儲存液的配方 41
參考文獻 48
第7章 酶活性的測定 49
1.引言 49
2.催化活性的原理 50
3.酶活性的檢測 54
4.反應分析混合物的組成 57
5.討論 58
參考文獻 58
第8章 蛋白質(zhì)定量 60
1.引言 61
2.試劑配制的一般性指導 65
3.紫外吸收光譜分析 65
4.基于染料的蛋白質(zhì)分析方法 67
5.考馬斯亮藍蛋白質(zhì)濃度分析法(范圍：1～50μg) 69
6.堿性銅還原分析法（范圍：5～100 ug） 70
7.二喹啉酸法（范圍：0.2～50 ug） 71
8.胺衍生法(范圍：0.05～25μg) 72
9.基于去污劑的熒光檢測（范圍：0.02～2μg） 73
10.總論 74
參考文獻 76
第9章 蛋白質(zhì)濃縮和溶質(zhì)的去除 78
1.層析 79
2.電泳 82
3.透析 83
4.超濾 85
5.冷凍干燥 89
6.沉淀 91
7.緒晶 92
參考文獻 92
第10章 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的保持 94
1.蛋白質(zhì)失活的原因 94
2.常規(guī)處理方法 95
3.濃縮和溶劑條件 95
4.穩(wěn)定性實驗和儲存條件 96
5.蛋白質(zhì)水解和蛋白酶抑制劑 96
6.蛋白質(zhì)活性丟失 97
第3部分 重組蛋白的表達與純化 101
第11章 選擇重組蛋白表達的合適方法
1.引言 102
2.大腸桿菌 102
3.畢赤酵母 104
4.桿狀病毒／昆蟲細胞 105
5.哺乳動物細胞 106
6.蛋白質(zhì)的特性 108
7.重組蛋白的應用 109
8.結(jié)論 110
參考文獻 111
第12章 用于外源蛋白生產(chǎn)的細菌表達系統(tǒng) 114
1.引言 115
2.使用大腸桿菌生產(chǎn)外源蛋白 115
3.設(shè)計一個細菌表達方案 116
4.方案需求的評估 116
5.目標蛋白質(zhì)的分析 116
6.克隆 117
7.制備T4 DNA聚合酶處理的DNA片段 118
8.大腸桿菌細胞質(zhì)中的表達 119
9.大腸桿菌細胞質(zhì)中目標蛋白質(zhì)的表達 119
10.大腸桿菌中表達的外源蛋白質(zhì)的分析 120
11.使用自誘導培養(yǎng)基方案的小量表達培養(yǎng) 122
12.蛋白質(zhì)的周質(zhì)表達 123
13.大腸桿菌周質(zhì)腔中目標蛋白質(zhì)的表達 123
14.小規(guī)模滲透休克法 123
15.用于外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的其他細菌系統(tǒng) 125
16.其他載體和誘導條件 126
17.生產(chǎn)規(guī)模 126
參考文獻 127
第13章 畢赤酵母中的表達 129
1.引言 130
2.其他真菌表達系統(tǒng) 130
3.培養(yǎng)基和微生物操作技術(shù) 131
4.遺傳株的構(gòu)建 131
5.基因制備和載體選擇 133
6.電穿孔轉(zhuǎn)化法 134
7.DNA的制備 135
8.重組蛋白表達菌株的鑒定 137
9.分析方法的建立酵母印跡法 139
10.重組蛋白的翻譯后修飾（蛋白酶和糖基化） 140
11.挑選具有多拷貝表達框的克隆 141
參考文獻 142
第14章 桿狀病毒一昆蟲細胞表達系統(tǒng) 144
1.引言 145
2.桿狀病毒生物學和分子生物學的簡要回顧 145
3.桿狀病毒表達載體 147
4.桿狀病毒表達載體技術(shù)——早期 147
5.桿狀病毒表達載體技術(shù)——改進 149
6.桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的改進 149
7.親代桿狀病毒基因組的改進 150
8.桿狀病毒一昆蟲細胞系統(tǒng)的另一半 157
9.桿狀病毒表達載體的新一代昆蟲細胞宿主 158
10.桿狀病毒的基本操作方案 160
參考文獻 163
第15章 哺乳動物細胞瞬時基因轉(zhuǎn)移法制備重組蛋白 167
1.引言 167
2.TGE方法tft常用的HEK293和CHO細胞系 168
3.用于HEK293和CHO細胞的表達載體 170
4.HEK293和CHO細胞系的懸浮培養(yǎng) 171
5.轉(zhuǎn)染方法 171
6.結(jié)論 175
參考文獻 176
第16章 用于蛋白質(zhì)表達的標簽 180
1.引言 181
2.設(shè)計具有標簽的蛋白質(zhì)時需要考慮的因素 183
3.蛋白質(zhì)親和標簽 185
4.可溶性標簽 188
5.標簽的去除 190
6.結(jié)論 192
參考文獻 192
第17章 包涵體蛋白溶解后的重折疊 197
1.引言 198
2.承折疊時通常需要考慮的因素 199
3.常規(guī)流程 200
4.常規(guī)操作方案 200
5.對該常規(guī)操作流程的評論 202
6.蛋白質(zhì)雨折疊條件的篩選實驗 207
7.其他的重折疊流程 210
8.霞折疊數(shù)據(jù)庫：REFOLD 211
9.提高可溶性蛋白比例的策略 212
10.結(jié)論 213
參考文獻 213
第4部分 提取物和亞細胞組分的制備
第18章 蛋白質(zhì)純化所需的生物提取物制備的研究進展 219
1.引言 220
2.化學法和酶法細胞裂解 220
3.機械法裂解細胞 223
4.結(jié)束語 225
5.細胞裂解的流程、試劑和技巧 225
參考文獻 231
第19章 亞細胞器及亞細胞結(jié)構(gòu)的分離 234
1.引言 235
2.亞蛋白質(zhì)組的提取和初步分離 237
參考文獻 253
第5部分 純化程序：量產(chǎn)法
第20章 蛋白質(zhì)沉淀技術(shù) 257
1.引言 258
2.AS沉淀 258
3.PEI沉淀 262
4.其他方法 265
5.沉淀分離蛋白質(zhì)的常規(guī)操作 265
參考文獻 266
第21章 用于去除核酸的Affi-Gel BLUE和核苷酸結(jié)合蛋白質(zhì)的初步富集 267
1.典型的方案 268
參考文獻 269
第6部分 純化程序：層析方法
第22章 離子交換層析 273
1.引言 273
2.原理 275
3.同定相 277
4.結(jié)合條件 278
5.洗脫條件 281
6.離子交換層析柱的操作 283
7.實例：復雜蛋白質(zhì)混合物的分離 285
8.實例：采用整體柱進行高分辨率的分離 288
參考文獻 289
第23章 凝膠過濾 290
1.原理 290
2.操作 291
第24章 羥基磷灰石柱用于蛋白質(zhì)層析 299
1.引言 300
2.機制 300
3.化學特性 302
4.純化操作規(guī)程的開發(fā) 306
5.實驗室規(guī)模層析柱的填裝 307
6.生產(chǎn)規(guī)模層析柱的填裝 308
7.應用 309
參考文獻 311
第25章 疏水作用層析在蛋白質(zhì)純化中的理論及應用 313
1.原理 313
2.HIC吸附劑的最新技術(shù) 315
3.HIC吸附劑的使用方法 316
參考文獻 319
第7部分 純化程序：親和法
第26章 親和層析：常規(guī)方法 323
1.引言 324
2.親和介質(zhì)的選擇 325
3.配基的選擇 327
4.化掌吸附作用 331
5.純化方法 334
參考文獻 335
第27章 固定化金屬親和層析：綜述 338
1.IMAC配基和同相離子的概況 339
2.IMAC的應用 342
3.結(jié)論 359
參考文獻 360
第28章 多羥基反應單克隆抗體的鑒定、生產(chǎn)和使用——用于免疫親和層析 365
1.引言 366
2.多羥基反應單克隆抗體 366
3.結(jié)論 377
參考文獻 378
第8部分 純化方法：電泳法
第29章 單向凝膠電泳 383
1.背景 384
2.聚丙烯酰胺凝膠 385
3.方法原理 386
4.步驟 387
5.凝膠中蛋白質(zhì)的檢測 391
6.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準 393
7.分子質(zhì)量測定 393
8.制備型電泳 394
參考文獻 395
第30章 等電聚焦和二維凝膠電泳 396
1.引言 397
2.材料 405
3.方法 406
參考文獻 414
第31章 蛋白質(zhì)凝膠染色法：介紹與概述 416
1.介紹 417
2.常規(guī)考慮 418
3.儀器：檢測和記錄 419
4.總蛋白質(zhì)的檢測 419
5.磷蛋白的檢測 427
6.糖蛋白昀檢測 428
參考文獻 430
第32章 凝膠中蛋白質(zhì)的洗脫 433
1.引言 433
2.通過擴散來洗脫凝膠中的蛋白質(zhì) 434
3.用反相HPLC代替SDvS凝膠電泳法 437
4.電泳洗脫 437
5.總結(jié) 437
參考文獻 /138
第33章 Western Blot的過程與優(yōu)化，著重于化學發(fā)光檢測 439
1.蛋白質(zhì)印跡法 440
2.蛋白質(zhì)印跡法的種類 441
3.檢測方法 444
4.化學發(fā)光信號 446
5.常見問題及其原兇 449
6.使用化學發(fā)光底物的印跡法和操作規(guī)程的優(yōu)化 453
參考文獻 457
第9部分 膜蛋白和糖蛋白的純化程序
第34章 去污劑：綜述 461
1.引言 462
2.去污劑結(jié)構(gòu) 462
3.溶液中去污劑的性質(zhì) 468
4.利用去污劑的物理化學參數(shù)進行膜蛋白的純化 470
5.去污劑的去除及置換 471
6.選擇合適的去污劑 471
7.結(jié)論 473
參考文獻 473
第35章 膜蛋白的純化 475
1.引言 475
2.膜的制備 476
3.天然膜蛋白的增溶 477
4.膜蛋白的純化 479
5.去污劑的去除和置換 480
6.重組整合膜蛋白的表達和純化 481
參考文獻 481
第36牽重組G蛋白偶聯(lián)受體的純化 483
1.引言 484
2.蛋白質(zhì)增溶的一般注意事項 484
3.蛋白質(zhì)純化的一般注意事項 485
4.增溶和純化重組神經(jīng)降壓肽受體NTS1 487
5.純化的NTS1分析 490
6.總結(jié) 491
參考文獻 491
第37章 整合膜蛋白在單室脂質(zhì)體中的無細胞翻譯 494
1.引言 495
2.九細胞翻譯系統(tǒng)概述 496
3.表達載體 497
4.基因克隆 498
5.PCR產(chǎn)物純化 500
6.Flexi載體和PCR產(chǎn)物酶切反應 501
7.連接反應 501
8.轉(zhuǎn)化反應 502
9.質(zhì)粒DNA的純化 503
10.mRNA制備 504
11.脂質(zhì)體的制備 504
12.小麥胚芽翻譯反應 505
13.密度梯度超速離心純化 507
14.脂蛋白體的性質(zhì) 509
15.規(guī)�；�的注意事項 510
16.同位素標記進行結(jié)構(gòu)研究 510
17.總結(jié) 511
參考文獻 511
第10部分 純化蛋白質(zhì)的特性
第38章 蛋白質(zhì)純度測定 517
1.蛋白質(zhì)的組成和活性分析 519
2.電泳法 520
3.色譜法 522
4.沉降速率測定法 523
5.質(zhì)譜法 524
6.光散射法 524
參考文獻 525
第39章 蛋白質(zhì)亞基的存在及其大小和分子質(zhì)量的測定 526
1.引言 527
2.化學方法 528
3.傳輸方法 530
4.散射方法 543
5，蛋白質(zhì)亞基的存在 544
參考文獻 546
第40章 翻譯后修飾蛋白質(zhì)的定性和定量 548
1.引言 549
2.用于鑒定PTM的富集技術(shù) 552
3.蛋白質(zhì)的硝化修飾 559
4.甲基化和乙酰化 560
5.質(zhì)譜分析 561
6.CID、ECD和ETD的對比 563
7.PTM的定量分析 566
8.展望 570
參考文獻 571
第11部分 其他技術(shù)
第41章 表達與純化的平行方法 579
1.引言 579
2.基于最終用途的策略 580
3.用于構(gòu)建表達構(gòu)建體的平行克隆策略 582
4.小規(guī)模表達篩選以鑒定合適的構(gòu)建體 584
5.用于選擇的蛋白質(zhì)的分析測試 587
6.大規(guī)模平行表達 588
7.總結(jié) 591
參考文獻 591
第42章 氧敏感蛋白的分離技術(shù)：以[4Fe-4S]-FNR為例 593
1.引言 594
2.4Fc-FNR的厭氧分離 595
3.含F(xiàn)NR的[4Fe-4S]2+族蛋白質(zhì)的特征 601
4.總結(jié) 604
參考文獻 605
第12部分 結(jié)束語
第43章 純化程序的再思考 609
1.介紹 609
第44章 蛋白質(zhì)生物化學中重要的卻鮮為人知（或易被忽略）的幾點 611
1.引言 611
2.SDS凝膠電泳樣品的制備 612
3.緩沖液 613
4.色譜 614
5.過濾過程中的蛋白質(zhì)吸收 615
6.塑料制品中的化學物浸出 615
7.尿素中的氰酸鹽 615
參考文獻 616
索引 617