本書為高等學校生物技術與生物工程專業(yè)課程iCourse 教材，系統(tǒng)介紹了細胞工程基礎、原理、關鍵技術及其應用，以及本領域的最新研究成果，突出細胞工程在解決相關重大理論問題及其實踐應用方面的特色。全書分為13 章，前3 章主要介紹細胞工程的發(fā)展簡史、理論和實驗基礎；第4 章至第7 章主要介紹細胞工程關鍵技術；第9 至第13 章主要介紹細胞工程應用實踐。本書各章既獨立成章、又相互聯(lián)系，內(nèi)容安排相互銜接，既強調(diào)系統(tǒng)性和基礎性，又緊扣應用實踐。
細胞工程是現(xiàn)代生物技術與生物工程的重要組成部分，是細胞生物學與發(fā)育生物學和遺傳學的交叉領域，無論在生命科學基礎研究方面還是在生物高科技產(chǎn)業(yè)領域，都已取得舉世矚目的成就，并取得了顯著的社會效益和經(jīng)濟效益。細胞工程已成為高等院校生物技術、生物工程及相關專業(yè)的主修課程，也是農(nóng)學、醫(yī)藥等相關專業(yè)的重要課程。細胞工程所涉及的主要技術領域有細胞培養(yǎng)、細胞融合、細胞拆合、染色體操作及基因轉(zhuǎn)移等諸多方面，其理論知識寬厚，應用十分廣泛。近年來，隨著互聯(lián)網(wǎng)發(fā)展，教育信息化和國際化日益凸顯，學生的學習方式發(fā)生了悄然改變，原有教學方式受到越來越大的挑戰(zhàn)，需要積極探索適應學生學習方式轉(zhuǎn)變的新型教育教學方式方法。慕課（Massive Open On line Course，MOOC，大規(guī)模開放在線課程）順應時代發(fā)展應運而生，同時，翻轉(zhuǎn)課堂、混合課堂等新的教學模式探索逐漸普及。在新的教學模式中，教師角色由講授者轉(zhuǎn)變?yōu)檎n程電子資源建設者和提供者，以及教學過程的引導者、啟發(fā)者，充分體現(xiàn)了“以學生為中心”的學習者主體地位，極大促進了學生自主學習、主動探索和創(chuàng)新思維能力的培養(yǎng)。為了進一步提高教學效果和質(zhì)量，必須建設與此相適應的新形態(tài)教材，幫助學生盡快適應新的教學方式。本書正是順應這一發(fā)展需要編寫的新形態(tài)教材，紙質(zhì)教材與數(shù)字課程一體化設計：紙質(zhì)教材設置了知識導圖、主干內(nèi)容、思考題和開放討論題等內(nèi)容；數(shù)字課程提供了與紙質(zhì)教材配套的知識拓展、深入學習、應用案例、視頻、動畫、本章小結(jié)、教學課件、自測題、參考文獻等資源。這種教材構(gòu)架方式，一方面可以幫助學生更好地理解并掌握知識點，另一方面可以幫助學生重構(gòu)學習方式，引導學生自主學習和探索，同時給予學生更大的自主選擇權。
本書系統(tǒng)介紹了細胞工程基本原理、關鍵技術及其應用實踐，以及本領域的最新研究成果，突出細胞工程在解決重大理論問題及應用實踐方面的特色。各章節(jié)由在該領域長期進行研究的學者編著，很好地反映了該領域的研究進展。全書分為13章，前3章主要介紹細胞工程的發(fā)展簡史、理論和實驗基礎；第4至7章主要介紹細胞工程關鍵技術；第8至13章主要介紹細胞工程的應用實踐。本書各章既相對獨立、又相互聯(lián)系，內(nèi)容安排相互銜接，既強調(diào)系統(tǒng)性和基礎性，又緊扣應用實踐。通過本教材的學習，學生可全面掌握細胞工程的原理和關鍵技術，并熟悉細胞工程的應用實踐，為學生今后的發(fā)展打下良好的理論和技術基礎。此外，本書按照研究的思路提出科學問題，并采用各種技術手段來求證，并在此基礎上提出新的問題，邏輯性強。本書可供高等院校生物技術、生物工程及相關專業(yè)的本科生和研究生使用，也可作為科研工作者參考書。
本書由余龍江教授（華中科技大學）擔任主編，鄧寧教授（暨南大學）、李青旺教授（西北農(nóng)林科技大學）、付春華副教授（華中科技大學）擔任副主編。華中科技大學的陳明潔、敖明章和楊英副教授，河北大學康現(xiàn)江教授，吉林大學單亞明教授和黃宜兵副教授，暨南大學唐勇教授和王永飛副教授，中國科學院武漢植物園章焰生研究員，西北農(nóng)林科技大學江中良和孫秀柱副教授，黑龍江八一農(nóng)墾大學趙蕊副教授等老師參與了教材編寫。付春華、余龍江對書稿進行了全面統(tǒng)稿和核校。同時，華中科技大學生命科學與技術學院的董艷山、張蒙、王碩、聶琳、戴露丹等研究生參與核校了部分書稿，付出了辛勤勞動。本書出版得到了高等教育出版社的大力支持和全力合作。在此一并表示誠摯謝意。
由于本書涉及的知識面較廣，而且該領域及相關學科發(fā)展很快，加之時間緊、任務重，編者業(yè)務水平有限，書中難免存在不足甚至瑕疵，敬請讀者不吝賜教，以便及時更正和完善。
編者
2016年8月
1 緒論
1．1 細胞工程概述
1．1．1 細胞工程概念
1．1．2 細胞工程基本內(nèi)容
1．2 細胞工程發(fā)展簡史
1．2．1 探索期
1．2．2 奠基期
1．2．3 蓬勃發(fā)展期
1．3 細胞工程發(fā)展前景
1．3．1 細胞工程理論發(fā)展前景
1．3．2 細胞工程技術發(fā)展前景
1．3．3 細胞工程應用前景
1．4 細胞工程學習方法
2 細胞工程理論基礎
2．1 細胞全能性
2．1．1 細胞全能性定義
2．1．2 細胞全能性研究歷史
2．1．3 細胞全能性應用
2．2 細胞分化與脫分化
2．2．1 細胞分化
2．2．2 細胞脫分化
2．3 細胞融合
2．3．1 細胞融合的概念
2．3．2 細胞融合的基本原理
2．4 合成生物學與人工細胞
2．4．1 合成生物學概述
2．4．2 合成生物學關鍵技術
2．4．3 人工細胞
3 細胞工程實驗基礎
3．1 細胞工程實驗室的規(guī)劃設計及常用儀器設備
3．1．1 基本實驗室
3．1．2 輔助實驗室
3．2 無菌操作技術
3．2．1 培養(yǎng)用品的清洗
3．2．2 滅菌原理與方法
3．2．3 無菌操作技術
3．2．4 無菌操作技術的注意事項
3．2．5 污染的檢測與控制
3．3 培養(yǎng)基的設計與優(yōu)化
3．3．1 植物細胞培養(yǎng)基的設計與優(yōu)化
3．3．2 動物細胞培養(yǎng)基的設計與優(yōu)化
4 細胞組織培養(yǎng)技術
4．1 植物細胞組織及器官培養(yǎng)技術
4．1．1 植物細胞和組織培養(yǎng)
4．1．2 植物器官培養(yǎng)
4．1．3 植物細胞組織開放式培養(yǎng)
4．2 動物細胞組織及器官培養(yǎng)技術
4．2．1 動物細胞培養(yǎng)
4．2．2 動物組織培養(yǎng)
4．2．3 動物器官培養(yǎng)
5 細胞融合技術
5．1 細胞融合技術概述
5．1．1 細胞融合方法
5．1．2 融合細胞的篩選
5．2 細胞融合技術發(fā)展歷程
5．3 動物細胞融合——雜交瘤技術
5．3．1 雜交瘤技術概述
5．3．2 單克隆抗體制備基本原理
5．3．3 單克隆抗體制備基本流程
5．3．4 雜交瘤細胞的篩選
5．3．5 單克隆抗體細胞株的建立
5．4 植物細胞融合技術
5．4．1 植物原生質(zhì)體制備
5．4．2 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)
5．4．3 植物原生質(zhì)體融合
5．4．4 植物體細胞雜種植株的鑒定
6 細胞拆合與克隆技術
6．1 細胞拆合
6．1．1 細胞拆合技術發(fā)展概況
6．1．2 細胞拆合技術：
6．1．3 細胞器重組
6．1．4 轉(zhuǎn)染色體核移植技術
6．2 克隆技術
6．2．1 克隆的概念和分類
6．2．2 克隆技術研究進展
6．2．3 胚胎分割技術
6．2．4 哺乳動物克隆
7 干細胞技術
7．1 干細胞概述
7．1．1 干細胞定義
7．1．2 干細胞分類
7．2 干細胞制備方法
7．2．1 胚胎干細胞制備方法
7．2．2 成體干細胞制備方法
7．2．3 誘導多能干細胞制備方法
7．2．4 腫瘤干細胞制備方法
7．3 干細胞研究進展
7．3．1 胚胎干細胞研究進展
7．3．2 成體干細胞研究進展
7．3．3 誘導多能干細胞研究進展
7．4 干細胞臨床應用
7．4．1 干細胞及其衍生產(chǎn)品上市情況
7．4．2 干細胞治療的困境和對策
8 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)
8．1 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)概述
8．1．1 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)概念
8．1．2 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)特點
8．2 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)的關鍵技術
8．2．1 植物細胞系建立
8．2．2 高產(chǎn)細胞系選育
8．2．3 高產(chǎn)細胞系保存
8．2．4 植物細胞放大培養(yǎng)技術及工藝
8．2．5 產(chǎn)物分離純化
8．3 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)天然活性物質(zhì)的調(diào)控
8．3．1 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的誘導表達調(diào)控
8．3．2 植物細胞響應外界刺激積累次生代謝物合成的信號轉(zhuǎn)導途徑
8．3．3 植物天然活性物質(zhì)合成的分子調(diào)控機制
8．4 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)貴重藥物應用實例
8．4．1 紫杉醇生物合成的代謝調(diào)控
8．4．2 人參皂苷生物合成和次生代謝調(diào)控
9 植物組織快速繁殖生產(chǎn)試管苗
9．1 植物快速繁殖的概述
9．1．1 植物快速繁殖的概念
9．1．2 植物快速繁殖的特點
9．2 植物脫毒培養(yǎng)技術
9．2．1 植物脫毒和快速繁殖的意義
9．2．2 植物脫毒培養(yǎng)的方法及原理
9．2．3 植物脫毒苗的鑒定
9．3 人工種子
9．3．1 人工種子的概念
9．3．2 人工種子各構(gòu)成部分的特點
9．3．3 人工種子的儲藏
……
10 植物細胞工程育種
11 動物細胞工程制藥
12 胚胎移植與試管動物
13 轉(zhuǎn)基因動物及其應用
�。�4）微核體的制備
秋水仙堿及其衍生物和長春花堿等能干擾微管的形成，染色體就被停滯在有絲分裂中期。動物細胞受秋水仙堿作用，形成了體積不同的多個微核，經(jīng)用細胞松弛素B把微核從細胞中分離出來，就叫作微核體，它只含有細胞中的少數(shù)染色體。使微核體與完整細胞融合，是進行基因定位的重要方法。
制備微核體的時候，用0.1μg/mL秋水仙堿處理細胞（48h以上），細胞分裂就被控制在分裂中期，此時染色體運動終止，在單個染色體或染色體群的周緣重現(xiàn)核膜，形成了大小不同的多數(shù)微核，此時的細胞就叫微核化細胞。然后借細胞松弛素B與離心并用的脫核法使微核從細胞分離出來成為微核體。
�。�5）植物細胞核和無核原生質(zhì)體的制備
植物細胞外部有一層細胞壁，先要去掉這一障礙，就是首先制備原生質(zhì)體，然后把收集的原生質(zhì)體放在低滲溶液中（或蒸餾水中）使原生質(zhì)體破裂，但核膜完整保留，然后用密度梯度離心法收集細胞核。酵母菌細胞核的提取方法與此相同。要得到無核的原生質(zhì)體（不是碎片），采用與動物細胞制備胞質(zhì)體相似的辦法，就是用細胞松弛素處理后的原生質(zhì)體，再進行高速離心，此時原生質(zhì)體分為兩部分，即無核的原生質(zhì)體和微型原生質(zhì)體（核外仍有少量細胞質(zhì)和質(zhì)膜）。經(jīng)純化可獲得純凈的無核原生質(zhì)體。應用透射電鏡技術，揭示剛?cè)ズ瞬痪玫募毎麨閳A形，以后逐漸鋪展開。去核細胞的一些細胞器的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、分布排列均與真核細胞相似，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系、高爾基體、多核糖體、溶酶體和中心粒以及微粒、微管等骨架系統(tǒng)和微小的胞飲泡等均呈正常分布。線粒體從去核的胞質(zhì)體中央部位重新分布于鋪展的胞質(zhì)區(qū)，它的運動十分活躍，膜上各酶系的分布及作用過程都照樣存在。觀察證明，去核細胞在一段時間內(nèi)，其胞質(zhì)內(nèi)細胞器的超微結(jié)構(gòu)是正常的。因此，去核細胞質(zhì)體是深入研究細胞質(zhì)作用的重要材料。
6.1.3細胞器重組
細胞器重組，是將分離得到的細胞器在一定條件下重新組合，形成雜種細胞的過程。
細胞器重組主要有三種形式，即胞質(zhì)體與核體重組、微核體與細胞重組、胞質(zhì)體與細胞重組。
（1）胞質(zhì)體與核體重組
胞質(zhì)體與核體重組又稱為核轉(zhuǎn)移，是將一個細胞的細胞核轉(zhuǎn)移到另一個細胞的胞質(zhì)體中，獲得雜種細胞的過程。
核轉(zhuǎn)移的方法主要有核質(zhì)融合法和顯微注射法。
�、俸速|(zhì)融合法核質(zhì)融合法是將獲得的胞質(zhì)體與核體混合，加入適宜的助融劑（如聚乙烯醇、仙臺病毒等），在一定條件下處理一定時間，使核體融合到胞質(zhì)體中，然后在一定條件下培養(yǎng)一定時間獲得雜種細胞的方法。其操作方法與原生質(zhì)體融合的方法基本相同。
�、陲@微注射法顯微注射法是通過特制的顯微注射器，將一個細胞的細胞核吸出，再移入另一個去核細胞中的方法。這個方法已經(jīng)在哺乳動物細胞的核移植方面成功應用，即首先將哺乳動物的受精卵去核，制備得到胞質(zhì)體，通過顯微注射器將動物體細胞的細胞核取出，轉(zhuǎn)移到去核受精卵中，再將接受了核轉(zhuǎn)移存活的受精卵移植入雌性動物的子宮中發(fā)育成個體。用這個方法已經(jīng)成功地克隆了綿羊、牛、豬等動物。
�。�2）微核體與細胞重組
微核體與細胞重組是將分離獲得的微核體與動物細胞或植物、微生物原生質(zhì)體混合，加入適宜的助融劑，在一定條件下處理一段時間，使微核體進入動物細胞或植物、微生物的原生質(zhì)體中，以獲得雜種細胞。在前述的動物細胞融合和原生質(zhì)體融合過程中，經(jīng)過融合獲得的含有兩種不同細胞核的異核體，要經(jīng)過體內(nèi)重組（核融合），才能獲得穩(wěn)定的融合子。
在雜種細胞分裂過程中，傾向于保留一個親本的全套染色體而排斥另一個親本的某些染色體。要得到穩(wěn)定的融合子，需要經(jīng)過相當長的時間，同時保留下來的部分染色體也并非完整的染色體。通過微核體與細胞的融合，就可以在短時間內(nèi)把少量而又完整的染色體引入細胞，獲得穩(wěn)定的融合子。微核體與細胞融合的方法與前述動物細胞融合和原生質(zhì)體融合的方法基本相同，在此不再贅述。
�。�3）胞質(zhì)體與細胞重組
胞質(zhì)體與細胞重組是將胞質(zhì)體與動物細胞或者植物、微生物原生質(zhì)體混合，在助融劑的作用下，經(jīng)過膜融合和胞質(zhì)融合，獲得胞質(zhì)雜種細胞的技術過程。胞質(zhì)體與細胞重組雖然沒有改變親本細胞的細胞核，但是由于引入的胞質(zhì)體細胞質(zhì)中含有蛋白質(zhì)等物質(zhì)，也可能對細胞或者個體的特性產(chǎn)生影響。胞質(zhì)體與細胞或原生質(zhì)體的融合方法與原生質(zhì)體融合方法相同。經(jīng)過細胞器重組獲得的融合子還需經(jīng)過篩選。篩選融合子的方法主要有：利用營養(yǎng)缺陷型標記進行篩選，利用抗藥性標記進行篩選，利用摻人熒光素標記進行篩選等。
細胞拆合技術是一種很有用的手段，就基礎研究而言，通過這種技術證明了細胞核的核酸合成方式和基因表達是受細胞質(zhì)物質(zhì)的影響。例如小鼠淋巴細胞是不產(chǎn)生白蛋白的，用它和能分泌白蛋白的大鼠肝癌細胞融合，可以產(chǎn)生有特異功能的雜種細胞，既能生產(chǎn)大鼠白蛋白，也能產(chǎn)生小鼠白蛋白。細胞拆合技術已被用于動物育種工作，童第周曾用核移植的方法育成鯉鯽核質(zhì)雜交魚，以選育新品種。
……
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